【摘要】   目的   揭示原位肝移植后移植物抗宿主病（ GVHD ）相关实验结果，探讨诊断依据及死亡原因。 方法   对 2002 年 5 月 -2008 年 5 月 1013 例原位肝移植后临床表现为 GVHD 的 13 例患者的血常规、肝功能和微生物学检查结果进行回顾性分析，并对其中 5 例患者行骨髓细胞学检查、 5 例行病理检查、 4 例行细胞因子检测、 6 例行嵌合体检测。 结果   13 例 GVHD 患者均表现出白细胞不同程度减少，其中 8 例极度缺乏； 9 例患者肝功能大致正常； 10 例患者血液、胆汁、创口分泌物、粪便和痰细菌培养阴性。 4 例患者骨髓造血细胞受抑甚至无造血细胞生成， 5 例患者病理检查结果符合 GVHD 。 4 例患者细胞因子检测发现白细胞介素（ IL ） -1 α、 lL-1 β、 IL-2 、 IL-4 在 GVHD 病程中低表达或无表达； IL-10 除 1 例在 GVHD 发病前高表达外，其余患者中的表达水平均减低；单核细胞趋化蛋白、血管内皮生长子、 IL-6 、表皮生长因子和 IL-8 逐渐增高或持续高表达；肿瘤坏死因子α随病程轻微增高；干扰素γ仅在 GVHD 发病初期有轻微改变。 1 例患者检查到嵌合体。 结论   嵌合体是确诊 GVHD 可靠但非惟一的依据，还需通过病理学、骨髓象、微生物学、肝功能、血常规及细胞因子检查，综合分析并结合临床表现进行鉴别诊断，骨髓造血功能衰竭导致的感染和出血是死亡的主要原因。

【关键词】   肝移植； 移植物抗宿主病； 嵌合体； 骨髓衰竭

The experimental results of GVHD following orthotropic liver transplantation    YAO Gui-ling, LI Wei, LIU Ai-bing, LIANG Hui, SONG Li-jie, WANG Mei-e, LIU Yuan-ming, WANG Li, WANG Hai-yan. Clinical Laboratory, General Hospital of Chinese People’s Armed Police, Beijing 100036, China

Corresponding author: WANG Hai-yan, Email: wanghaiyan1952@ 163.com

【 Abstract 】 Objective     To analyze experimental results of Graft-versus-host disease (GVHD) after liver transplantation. Methods     13 cases of GVHD out of the 1013 liver transplantation between 2002-2008 were analysed. Routine blood test, liver function and microorganisms test were done in all of the 13 cases, bone marrow test was done in 5 cases, liver pathological test was done in 5 cases, cytokines were analyzed in 4 cases, chimerism test was done in 6 cases. Results     Leukocytes were reduced to various degree in all 13 cases, and were extremely low in 8 cases. Hematopoiesis was repressed in 4 cases. Normal liver function was found in 9 cases. Bacterium were found in blood, bile, wound secrete juice, excrement, phlegm of 10 cases. The pathological characteristics was in accordance with GVHD in 5 cases. The levels of IL-1 α , IL-1 β , IL-2, IL-4 were low or undetectable. IL-10 was decreased in 4 cases but increased in 1 case. MCP-1, VEGF, IL-6, EGF, IL-8 were increasing or remained at high level during GVHD. TNF α was slightly increased. IFN γ was only slightly changed before GVHD. Conclusion     Chimerism is a reliable but not unique evidence of GVHD.

【 Key words 】 Liver transplantation;   Graft vs host disease;   Chimera;   Marrow failure

截止 2008 年，全球报道肝移植后发生移植物抗宿主病（ graft versus host disease ， GVHD ）约 80 例 [1] 。肝移植术后发生的 GHVD 发病率低（约 1% ），病死率高（ 85% ），诊断率低，是非常凶险的疾病，其病因至今仍不十分清楚，且早期很难与病毒感染或药物反应相区别 [2-3] 。诊断 GVHD 的依据是从器官或组织找到供者淋巴细胞嵌合体 [4] ，但多数患者检出嵌合体时病程已到中晚期，少数因多种因素未能检出嵌合体者依据临床回顾确诊。目前 GVHD 仍然没有特异的早期诊断方法，部分患者因未能确诊而贻误治疗。

资料与方法

1 ．病例来源： 2002 年 5 月 -2008 年 5 月，我院实施原位肝移植（ orthotopic liver transplantation ， OLT ）的 1013 例患者中， 13 例临床表现为 GVHD 。 GVHD 诊断根据 3 个条件 [5] ：（ 1 ）涉及到靶器官（皮肤、骨髓及胃肠道）临床症状；（ 2 ）组织学证据；（ 3 ）在侵袭的器官和外周血中找到供者白细胞的人类白细胞抗原或 DNA 证据。

2 ．血常规检查：应用 Sysmex9000 型全自动血细胞分析仪及配套试剂（购自日本希森美康公司），使用前用希森美康公司提供的标准品或质控品进行校正，采集空腹静脉血，检查血常规及网织红细胞。

3. 肝功能检查：采集空腹静脉血，应用日立 7170 全自动生物化学分析仪及配套试剂动态监测 ALT 、γ - 谷氨酰转肽酶、总胆红素、直接胆红素、乳酸脱氢酶。

4 ．骨髓细胞学检查：当白细胞减低后，抽取骨髓液，经瑞氏染液染色，显微镜下分类，以百分比报结果，诊断参照血液病诊断及疗效标准。

5. 微生物检查：对 OLT 后不同时间的血液、痰、胆汁、创口分泌物、粪便进行细菌学培养，法国生物梅里埃公司 VITEK2 鉴定仪鉴定。

6. PCR-STR （短串联重复系列）：取供者和受者石蜡包埋肝组织提取 DNA ；受者术后发病时抽血，乙二胺四乙酸 -2K 抗凝血，提取 DNA 。使用 Identifiler 复合扩增试剂盒，扩增反应分别采用 10 μ l 和 20 μ l 体积，美国 ABI 公司 ABI-310 型自动测序仪检测扩增产物， Genescan 和 Genotyper 软件进行 16 个位点的 STR 分型，由中国政法大学证据科学研究院法大法庭科学技术鉴定研究所完成。

7 ．病理学检查：取皮肤组织，送北京协和医院皮肤科检测。

8 ．细胞因子检测：收集临床及病理学确诊 GVHD 的患者，在 GVHD 发生前后 5 个不同阶段的血清，由解放军第三 O 一医院生物化学科应用 EVIDENCE180 型全自动化学发光生物芯片分析仪及细胞因子试剂盒（均购自英国 RANDOX 公司）进行 12 种细胞因子检测，包括白细胞介素（ IL ） -1 α、 IL-1 β、 IL-2 、 IL-4 、 IL-6 、 IL-8 、 IL-10 、肿瘤坏死因子、干扰素γ、表皮细胞生长因子、血管内皮生长子、单核细胞趋化蛋白。

结     果

1 ．一般情况：实施 OLT 的 1013 例患者中， 13 例术后临床表现 GVHD ，其中男 12 例，女 1 例；年龄 30 岁～ 2 例， 40 岁～ 4 例， 50 岁～ 4 例， 60 ～ 70 岁 3 例。原发病包括：原发性肝癌 8 例；乙型肝炎后肝硬化 4 例；丙型肝炎后肝硬化 1 例； 2 例术前脾切除； 1 例术前患糖尿病； 1 例术后第 2 天腹腔内出血，行剖腹止血手术。患者出现发热、皮疹和腹泻的情况见表 1 。 13 例患者发热出现在术后第 9 ～ 30 天。皮疹除 1 例外均在术后 20 ～ 33d 出现，多遍及颈、胸、背、腹、四肢，斑丘皮疹略高于皮肤。 1 例鼻黏膜多处溃烂，阴囊皮疹，偶见水疱形成； 6 例口腔黏膜多处糜烂及溃疡。腹泻表现为水样便，时间不定。 4 例皮疹出现前行 T 管造影（造影剂为安射力）。

表 1   （略）

2 ．血常规及生物化学检查结果：白细胞减少多在发热、皮疹后出现， 5 例患者首先是白细胞迅速下降，随后出现骨髓抑制。发病期间白细胞最低时，＜ 0.5 × 109/L 者 5 例，（ 0.5 ～＜ 2.0 ）× 109/L 者 3 例，（ 2.0 ～ 4.72 ）× 109/L 者 5 例。病例 6 血红蛋白正常，其余患者均有不同程度贫血。病例 5 、 6 、 8 、 12 血小板正常，其余患者低于正常值。网织细胞水平除病例 5 外，均＜ 0.5% 。病例 2 、 4 胆红素代谢不同程度增高，病例 6 ALT 增高，病例 1 、 11 、 12 胆道酶轻度增高，病例 13 胆道酶显著增高，其他结果大致正常。见表 2 。

3 ．骨髓细胞检查： 5 例患者（病例编号 1 、 2 、 3 、 4 、 10 ）进行了骨髓细胞学检查， 4 例表现为骨髓增生极度降低，粒细胞及红细胞系统受到显著抑制。其中死亡病例 10 无粒细胞、红细胞和巨核细胞，以淋巴细胞为主伴大量非造血细胞及吞噬细胞。死亡病例 2 分别见到 1% 嗜中性粒细胞、 1% 嗜酸性粒细胞、 1% 嗜碱性粒细胞，红细胞系统未见幼红细胞，巨核细胞全片 20 个。病例 3 见 0.5% 早幼粒细胞、 1% 原红细胞、 1% 早幼红细胞，巨核约 20 个，血小板少见，可见非造血细胞团。病例 1 嗜中性粒细胞 3% ～ 7% ，红细胞系统未见，巨核细胞 5 个、吞噬细胞 8% 、以淋巴细胞为主伴两堆非造血细胞团。病例 4 骨髓增生活跃，各阶段嗜中性粒细胞 75% ，分叶 2.0% ，中、晚幼红细胞 10% ， 49 个巨核细胞（明显的骨髓受抑，用粒细胞集落刺激因子治疗后，骨髓造血恢复骨髓象）。

4 ．微生物学检查：白细胞减低前， 9 例患者血、胆汁、粪便、痰及创口分泌物细菌培养均阴性； 3 例培养出细菌：病例 5 胆汁培养出肠球菌，病例 7 胆汁培养出鸟肠球菌和切口金葡菌，病例 8 痰培养出白色念珠菌。白细胞减少后， 6 例培养出细菌：病例 1 胆汁培养出肠球菌，痰培养出大肠埃希氏菌和阴沟肠杆菌；病例 2 痰培养出烟曲霉菌，切口培养出革兰阴性杆菌，粪便培养出真菌；病例 3 胆汁培养出肠球菌，粪便培养出真菌；病例 4 粪便培养出真菌；病例 5 粪便培养出真菌，痰和胆汁培养出凝固酶阴性葡萄球菌；病例 7 传染性软疣病毒 -RAN （ + ），切口培养出金黄色葡萄球菌，胆汁培养出鸟肠球菌和凝固酶阴性葡萄球菌；病例 12 穿刺管培养出凝固酶阴性葡萄球菌。

5 ．嵌合体检查： 6 例（病例编号 8 、 9 、 10 、 11 、 12 、 13 ）供者、受者进行嵌合体检查。病例 10 经 PCR-STR 检测 16 个位点的 STR 分型，可以明显看到有混合样品，在 D8S1179 和 D21S11 两位点证实有嵌合体。其余 5 例（其中病例 13 应用 HLA 配型）未找到嵌合体。

6 ．病理学检查： 5 例（病例 4 、 5 、 6 、 9 、 13 ）患者皮肤活组织检查结果显示，基底层细胞液化变性，真皮浅层血管周围少量淋巴组织细胞及中性细胞，符合 GVHD 病理特征。

7 ．细胞因子检测： 4 例（病例 2 、 3 、 4 、 9 ）患者的 12 种细胞因子表达极不平衡：造血因子 IL-1 α、 IL-1 β、 IL-2 和 IL-4 不表达或低表达，其中病例 2 在 GVHD 期间有轻微增高； IL-10 除病例 4 在 GVHD 发生前增高外，其余表现减低；单核细胞趋化蛋白、血管内皮生长子、 IL-6 、表皮生长因子和 IL-8 高表达，反应最强烈的是单核细胞趋化蛋白，在 GVHD 初期及中期，分别高达 1200pg/ml 及 1166.07pg/ml 。

8 ．典型 GVHD 的实验结果：病例 10 具有典型的 GVHD 检查结果：男性， 67 岁，白细胞较低（ 0.09 × 109/L ），骨髓无造血功能，生物化学检查结果正常，微生物检测结果阴性， PCR-STR 检查找到嵌合体，死亡原因为脑出血和感染。

讨     论

目前 OLT 后 GVHD 的病因尚未完全清楚，多数学者认为 OLT 后 GVHD 的发生主要是源于移植物中富含干细胞和淋巴细胞，供者的淋巴细胞与受者淋巴细胞相互间免疫耐受的平衡被破坏，供者的 T 淋巴细胞被激活成为免疫活性细胞，对机体组织相容性抗原进行免疫攻击。由于受者存在免疫不平衡或免疫缺陷，使得供者的淋巴细胞通过释放细胞因子攻击靶器官或打破正常细胞因子的平衡造成靶器官（皮肤、骨髓或胃肠道）的严重损害，最终导致死亡 [6] 。

本研究结果显示 GVHD 的病程中有如下改变：（ 1 ）外周血以白细胞减少最迅速，类似粒细胞缺乏症，其次为血小板减少。白细胞分类与常见粒细胞缺乏症不同，粒细胞缺乏症淋巴细胞升高，而 GVHD 多数在白细胞减低时仍有高比值粒细胞存在，说明体内有重症感染。（ 2 ）造血功能衰竭：骨髓造血细胞极度减少，与外周血三系减少尤以白细胞减少相符合，并且在几天内急速下降，表现为无造血细胞或仅有少数造血细胞，伴大量淋巴细胞和吞噬细胞，与再生障碍性贫血不同的是还有一定数量的巨核细胞存在。当骨髓无造血细胞或仅有 1% 成熟分叶时，意味着生存希望很小。本组 2 例死亡，病例 3 的骨髓还有 1% 幼稚阶段细胞，经全力抢救，骨髓造血功能恢复后生存 [7] 。（ 3 ）微生物检查结果与文献 [8] 报道一致，多数患者发病后，白细胞减少前从血、尿、痰、粪便、胆汁、创口分泌物未培养出细菌。有 3 例标本培养出细菌，说明发病非炎症所致而是免疫复和物作用的结果。当白细胞减少后， 6 例引起严重细菌感染。（ 4 ）血液生物化学指标特点与文献 [9] 一致， ALT 、γ - 谷氨酰转肽酶、总胆红素、直接胆红素、乳酸脱氢酶除个别外均在正常范围，说明肝功能正常。（ 5 ）细胞因子检测结果说明， GVHD 为细胞免疫反应，主要由细胞因子介导，由淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞及其他组织细胞所释放的一群低分子质量的糖蛋白或多肽参与的复杂炎症反应。造血因子（ IL-1 α、 IL-1 β、 IL-2 、 IL-4 ）几乎没有，抗原提呈因子及炎症因子（单核细胞趋化蛋白、血管内皮生长子、 IL-6 、表皮生长因子、 IL-8 ）增高， IL-10 下调，与骨髓造血功能重度衰竭及感染有直接关系 [10] 。

GVHD 患者死亡原因是骨髓造血功能极度衰竭，甚至无造血细胞生成，导致外周血三系减少，尤其是粒细胞极度缺乏，抗感染能力丧失。本组患者死亡 4 例，病例 2 死于脑出血伴感染，病例 1 、 4 、 10 均死于重度感染。值得注意的是，当发现白细胞降低时，如果骨髓还有早期幼稚粒细胞，即使很少，通过及时治疗仍然有生存希望。                         

GVHD 多数以找到供者淋巴细胞或供者白细胞的 HLA 或 DNA 证据作为诊断最主要的依据，但并非所有 GVHD 患者都能顺利找到嵌合体 [11] 。肝、肾移植后长期存活的受者，其嵌合体不仅存在于器官还存在于全身，源于供者抗原提呈细胞白细胞系（包括 T 淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞）在受者多个器官发现（如血液、淋巴结、皮肤、肠），建立了稳定的嵌合状态。微嵌合体，即受者全部有核细胞含供者细胞＜ 1% ，这些迁移到脾、淋巴结、皮肤的嵌合细胞在受者外周血中很难检测到。系统嵌合体，即受者全部有核细胞含供者细胞＞ 1% ，在有症状的受者普遍观察到。假定混合的嵌合状态类似于体内混合淋巴细胞两种途径竞争反应，在受者的免疫反应和供者白细胞系平衡间，白细胞系决定是排异、 GVHD 或耐受状态。有报道提出嵌合状态有高蜂期，也有报道持续高嵌合状态始终未出现临床表现，说明嵌合体非 GVHD 的惟一诊断标准。本组仅 1 例患者检测到嵌合体，主要检测材料是血液，而未从皮肤、肠道和骨髓等其他器官和组织中检测，可能是检出率低的主要原因。其次，检测时机也许未在嵌合状态的高峰期，也可能存在微嵌合体，而受者免疫功能紊乱造成 GVHD 发生。因此未检测出嵌合体不意味 GVHD 不存在，应结合临床及病理综合分析 [12] 。

目前还没有针对 GVHD 的早期和特异诊断试验，且缺乏统一标准，本研究发现 GVHD 对骨髓靶器官损害最重，典型 GVHD 无造血细胞生成，而造血细胞因子缺乏是导致骨髓造血功能衰竭的主要原因。当临床怀疑 GVHD 时，应密切注意外周血白细胞改变，迅速给予治疗，白细胞能否恢复是扼制疾病发展的关键也是判断预后的标准。 GVHD 的发生是 OLT 后威胁患者生存的严重并发症，还应继续探讨病因及早期诊断的试验方法，希望通过上述实验结果能对 GVHD 的诊断及愈后提供帮助。

参   考   文   献

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