Regulation of hepatitis B virus replication regulated by HBX protein    WANG Jun-zhong, YANG Dong-liang.

【 Key words 】 Hepatitis B virus;   Virus replication;   X protein

【 First author’s address 】 Division of Clinical Immunology, Tongji Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China

Corresponding author: YANG Dong-liang, Email: dlyang@tjh.tjmu.edu.cn

乙型肝炎病毒 X 蛋白（ hepatitis B virus X protein ， HBx ）由一段 154aa 的多肽组成，由 HBV 的 X 基因编码，在肝癌的形成中起重要作用，并且广泛参与宿主细胞的基因表达、反式激活和细胞信号传导等 [1] 。 HBx 不能直接与 DNA 结合，但是能活化多种 DNA 顺式作用元件，如核因子κ B 、激活蛋白 1 、 激活蛋白 2 、 CCAAT 增强子结合蛋白、活化转录因子 /cAMP 反应元件结合蛋白等。 HBx 还能与某些基础转录组件作用，如转录因子Ⅱ B 、转录因子Ⅱ H 、 RNA 多聚酶的亚基和 TATA 结合蛋白等。通过这些靶结构， HBx 可反式激活多种细胞基因的转录。另外，在细胞质内， HBx 还能刺激多种细胞内信号转导通路，包括 Ras/Raf 丝裂原启动的蛋白激酶、 c-Jun 激酶、 JAK/STAT 激酶 C 等 [2] 。

一、 HBx 调节 HBV 的活跃复制

在转基因小鼠中， X 基因缺失突变后病毒的复制水平和持续时间没有明显变化，但是用表达 HBx 的转基因小鼠和 HBV 转基因小鼠杂交，其后代病毒复制的水平和持续时间均有明显提高 [3] 。土拨鼠肝炎病毒（ woodchuck hepatitis virue ， WHV ）的基因组和 HBV 极为相似， Zhang 等 [4] 发现， X 基因缺失或突变的 WHV 活性减弱，感染土拨鼠后只能产生较低水平的病毒血症。 Bouchard 等 [5] 将 HBx 表达缺失的感染性克隆 HBV ［ HBV （ -HBx ）］转染 HepG2 细胞后，病毒的复制水平下降了 95% 。如将 HBV （ -HBx ）和 HBx 表达质粒共转染，病毒的复制将回复到与野生型相当的水平，而 HBx 与野生型 HBV 感染性克隆共转染对病毒的复制没有明显的影响。 Keasler 等 [6] 利用小鼠尾静脉高压注射模型证实，小鼠肝脏内 HBV 的复制 75% 是 HBx 依赖性的， 25% 是 HBx 非依赖性的。 HBx 表达缺失时，肝脏内 HBV 的 3 种 RNA （ 3.5kb 、 2.4kb 、 2.1kb ）平均下降 72% ，核心蛋白的表达也显著下降，而外周血中 HBV 滴度则下降了 99% 。在人肝细胞嵌合小鼠中，接种 HBx 缺失突变的 HBV 不能产生病毒血症；如果同时接种 HBx 表达质粒，则能产生高水平的病毒血症 [7] ，这也证实了 HBx 是 HBV 在人肝细胞中活跃复制所必需的。

二、 HBx 调节 HBV 复制的机制

HBx 在 HBV 生命周期中起着重要的调节作用，但是 HBx 调节病毒复制的机制还不清楚，可能的机制包括以下几种。

1 ． Ca2+- 富含脯氨酸的酪氨酸激酶 2 （ proline-rich tyrosine kinase 2 ， Pyk2 ） / 局部黏附激酶（ focal adhesion kinase ， FAK ） -Src 途径： HBx 调节 HBV 复制是细胞质内钙离子依赖性的。 HBx 能与线粒体膜上的渗透性转换孔作用，增加细胞质内的 Ca2+ 浓度。在 HepG2 细胞中， HBx 缺失表达时， HBV 的复制水平显著下降，用 Ca2+ 激动剂刺激细胞增加细胞质内的 Ca2+ 水平，能使 HBV 的复制回复到野生型水平。相反，野生型 HBV 感染性克隆转染 HepG2 细胞后，同时用线粒体 Na+-Ca2+ 泵抑制剂减少细胞质内 Ca2+ 浓度，野生型 HBV 的复制水平与 HBx 表达缺失时相当 [5 ， 8-9] 。 Pyk2 和 FAK 是细胞质内的非受体酪氨酸激酶，在 Ca2+ 的调节作用下发生磷酸化而被激活。 Bouchard 等 [5] 发现， HBx 通过调节细胞质内 Ca2+ 水平激活 Pyk2 和 FAK ，进而促进 HBV 的复制。在 HepG2 细胞中，分别用 Pyk2 抑制剂和突变型的 FAK 刺激后，野生型 HBV 的复制下降了 15 倍以上，和 HBx 缺失的 HBV 复制水平相当 [5 ， 10] 。 Pyk2 和 FAK 磷酸化后能与能激活下游的 Src 激酶，而 Src 激酶的活化是 HBV 活跃复制所必需的。研究结果发现，当 HBx 表达缺失时， Src 激酶不能活化， HBV 的复制水平也显著下降。用野生型的 HBV 感染性克隆转染肝癌细胞，并同时阻断 Src 激酶的活化，其复制水平与 HBx 缺失突变型相当。另外， HBx 还能通过活化 Src 激酶激活下游的 Ras-Raf- 丝裂原活化蛋白激酶 -c-Jun 氨基末端激酶信号通路，调节细胞周期和促进病毒复制 [2] 。这表明， HBx 通过调控细胞质中的 Ca2+ 水平，激活 Pyk2/FAK-Src 酪氨酸激酶及其下游信号通路，促进 HBV 的复制。

2 ．损伤 DNA 结合蛋白（ dameged DNA binding protein ， DDB ） 1 结合途径：紫外线损伤 DNA 结合蛋白由 DDB1 和 DDB2 两个亚基构成，其中 DDB1 与 HBx 的适当结合是产生病毒感染和复制所必需的。 Sitterlin 等 [11] 构建 X 基因突变的 WHV 感染性克隆，使 HBx 与 DDB1 的结合增强或减弱，将这种突变的 WHV DNA 注射到土拨鼠肝脏内，不能产生病毒血症或延迟产生较弱的病毒血症。 Leupin 等 [12] 构建了一系列突变型的 X 基因表达载体，其表达的 HBx 与 DDB1 的结合有不同程度的降低。用这些 HBx 表达载体与 HBV （ -HBx ）共转染 HepG2 细胞，病毒的复制较 HBV （ -HBx ）有所增加，但均不能达到野生型的水平。其中， HBx 第 96 位氨基酸突变时， HBx 不能和 DDB1 结合，与 HBV(-HBx) 共转染后也不能提高病毒的复制。但是将 96 位氨基酸突变的 HBx 和 DDB1 融合表达，再与 HBV （ -HBx ）共转染，能显著提高病毒的复制水平。另外， DDB1 位于细胞核， HBx 与 DDB1 结合并调节 HBV 的复制也主要发生在细胞核。 Leupin 等 [12] 分别在野生型的 X 基因上添加核定位信号和核排除信号，核定位信号 -X 与 HBV （ -HBx ）共表达时能使病毒的复制回复到野生型水平，而核排除信号 -X 与 HBV （ -HBx ）共表达时对病毒的复制没有影响。最近有研究还发现，用 RNA 干扰技术分别阻断 HBx 和 DDB1 的表达均能抑制 HBV 的复制，同时阻断两者的表达后， HBx 的稳定性下降，抑制病毒复制的水平也大大增加 [13] 。

3 ．蛋白酶体途径：蛋白酶体是一类存在于细胞内的蛋白水解体系， HBx 在细胞内作为一种外来蛋白，是蛋白酶体的作用底物。研究结果发现， HBx 能与蛋白酶体的两个亚基 XAPC7 和 XAPC1 结合，这种结合可能是 HBx 发挥功能所必需的，用蛋白酶体抑制剂能阻断 HBx 的反式激活转录功能，而 XAPC7 和 XAPC1 的高表达能使其反式激活转录功能增强。 Zhang 等 [14-15] 将 WHV （ -HBx ）和 HBV （ -HBx ）转染 HepG2 细胞，同时用蛋白酶体特异性的抑制剂处理细胞，能使 WHV （ -HBx ）和 HBV （ -HBx ）的复制恢复到野生型水平，而野生型 WHV 和 HBV 复制没有改变，这提示蛋白酶体能调节 HBV 的复制，并且这种调节是 HBx 依赖性的。研究结果还发现， HBx 与蛋白酶体的两个亚基 XAPC7 和 XAPC1 之间的结合具有竞争抑制关系， HBx 与 XAPC7 和 XAPC1 结合后蛋白酶体降解蛋白的活性显著下降，所以 HBx 和蛋白酶体调节 HBV 复制的可能机制是在病毒的组装过程中， HBx 与蛋白酶体结合后抑制了蛋白酶体对病毒核衣壳的降解，从而促进病毒的复制和抑制细胞的抗病毒作用。

HBx 是 HBV 活跃复制所必需的，但具体机制还不清楚， HBx 是否影响 HBV RNAs 的生成也存在争议 [5 ， 12] ，有待进一步研究。

参   考   文   献

[1]Song JW, Lin JS. The role of X protein in the life cycle of hepatitis B virus. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2003, 11: 511-512. (in Chinese)

宋家武 , 林菊生 .X 蛋白在乙型肝炎病毒生命周期中作用的研究 . 中华肝脏病杂志 ,2003,11:511-512.

[2]Bouchard MJ, Schneider RJ. The enigmatic X gene of hepatitis B virus. J Virol, 2004, 78: 12725-12734.  

[3]Xu Z, Yen TS, Wu L, et al. Enhancement of hepatitis B virus replication by its X protein in transgenic mice. J Virol, 2002, 76: 2579-2584.  

[4]Zhang Z, Torii N, Hu Z, et al. X-deficient woodchuck hepatitis virus mutants behave like attenuated viruses and induce protective immunity in vivo. J Clin Invest, 2001, 108: 1523-1531.

[5]Bouchard MJ, Wang LH, Schneider RJ. Calcium signaling by HBx protein in hepatitis B virus DNA replication. Science, 2001, 294: 2376-2378.

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[11]Sitterlin D, Bergametti F, Tiollais P, et al. Correct binding of viral X protein to UVDDB-p127 cellular protein is critical for efficient infection by hepatitis B viruses. Oncogene, 2000, 19: 4427-4431.

[12]Leupin O, Bontron S, Schaeffer C, et al. Hepatitis B virus X protein stimulates viral genome replication via a DDB1-dependent pathway distinct from that leading to cell death. J Virol, 2005, 79: 4238-4245.

[13]Tang KF, Xie J, Chen M, et al. Knockdown of damage-specific DNA binding protein 1 (DDB1) enhances the HBx-siRNA-mediated inhibition of HBV replication. Biologicals, 2008, 36: 177-183.

[14]Zhang Z, Torii N, Furusaka A, et al. Structural and functional characterization of interaction between hepatitis B virus X protein and the proteasome complex. J Biol Chem, 2000, 275: 15157-15165.

[15]Zhang Z, Protzer U, Hu Z, et al. Inhibition of cellular proteasome activities enhances hepadnavirus replication in an HBX-dependent manner. J Virol, 2004, 78: 4566-4572.